Роль лабораторної діагностики при грибкових захворюваннях. Лабораторна діагностика мікозів * my dermatology

4402 0

На жаль, і зараз можна констатувати, що діагностика грибкових захворювань нерідко буває несвоєчасною (зони порідіння волосся, лущення часто приймаються за «лупу», «сухість»). При цьому суб'єктивні відчуття (свербіж, біль та ін.) в осередках ураження часто не бувають, і хворі через це довгий часне звертаються прийом до фахівця.

Зміни нігтів (потворні, кришаться, витончені) розцінюються як «оніходистрофії» після забитого місця, відморожень та ін. судини та інших. Хворі у своїй невизначено довго залишаються джерелом поширення грибкової інфекції. У зв'язку зі сказаним незмінно актуальною є своєчасна лабораторна діагностика мікозів, проведення можливо раннього лікування.

Різноманітність клінічних варіантів грибкових захворювань, що переважно зустрічаються у людини, а також особливості мікробіології, морфоструктури, імунологічних та інших параметрів різних видів (і пологів) грибів зумовило наявність значної кількостіметодів діагностики мікозів; Слід зазначити, що наявні методи безперервно удосконалюються і (порівняно недавно) мають своєрідний ухил у бік імунологічних та молекулярно-генетичних тестів.

З іншого боку, культуральні дослідження й досі «перебувають у розряді стандартів, близьких до золотим» і застосовуються на підтвердження сумнівних результатів інших досліджень; Існує думка, що поєднання культурального та молекулярно-генетичного методів при «сумнівних» у діагностичному плані формах мікозів (особливо дисемінованих, на тлі імуносупресії будь-якого генезу, з ураженням внутрішніх органів та ін) є одним з найбільш достовірних способів реєстрації мікотичної природи процесу.

Не слід, проте, нехтувати «старими» методиками, зокрема бактеріоскопією (особливо при первинному обстеженні), тим паче, що у повсякденній практиці мікроскопічна «верифікація» мікозу у багатьох дерматологічних установах застосовується найширше проти іншими тестами.

З урахуванням значного зростання кількості алергічних проявів на шкірі (а іноді й вісцеральних) - при тривалому, хронічному, періодично загострюваному перебігу мікозу (шкіри, нігтів та ін.) доцільна постановка алергологічних тестів, що дозволяють виявити ступінь сенсибілізації організму, в т.ч. поєднаної грибково-бактеріальної інфекції; даний факт може вплинути на специфіку лікування у конкретного хворого - наприклад, визначити раціональне призначення антимікотиків та засобів десенсибілізації та ін.

Традиційно, ймовірний діагноз грибкового захворювання ставиться на підставі клінічних проявів та підтверджується лабораторними дослідженнями.

У цьому розділі книги ми коротко наводимо базові методи реєстрації мікозів (незалежно від їхньої локалізації), враховуючи тип дослідження та взятий матеріал. Слід зазначити, що поліморфізм клінічних проявів мікозів (зокрема з алергічним компонентом) зумовлює різноманітність патологічного матеріалу, що підлягає дослідженню. При цьому успіх пошуку елементів гриба залежить від правильного його взяття.

Так, периферична зона еритемато-сквамозних, часто фігурних висипів багатша міцелієм, спорами гриба; на волосистих ділянках ураження беруться скрючене, білувате, знебарвлене, тьмяне волосся або його уламки — «пеньки» (забір волосся доцільно контролювати за допомогою лампи Вуда). Певних навичок вимагає забір матеріалу (за допомогою голки) із т.зв. "чорних точок" - темних рогових конусів у гирлах фолікулів.

У повсякденній практиці зазвичай досліджуються лусочки шкіри (збираються шляхом зіскрібка, мазка, з використанням липкої стрічки), зіскрібок змінених нігтів, зона піднігтьового гіперкератозу, а також відокремлюване слизових оболонок. За показаннями досліджують мокротиння, лаважну рідину, сечу (у пацієнтів з некатетеризованим. сечовим міхуром); сеча з сечоприймачів, підкладних суден може бути взята на дослідження.

Діагностичне значення має також кров (для культурального дослідження, а також ІФА, ПЛР), ліквор та інші біорідини організму (плевральна, внутрішньосуглобова, внутрішньочеревна - у т.ч. зібрані методом аспірації або дренування); в окремих випадках (залежно від топічного діагнозу) мають значення жовч, фекалії, пунктати підшкірних абсцесів, що відокремлюється нориць (особливо при глибоких мікозах). Навіть нескладні діагностичні тести потребують точного дотримання низки умов.

Для діагностики грибкових захворювань нині застосовуються методи:
- Мікроскопія; заснована на виявленні збудника у досліджуваному матеріалі, у т.ч. у тканинах людини;
- культуральне дослідження із подальшим мікроскопічним вивченням культури гриба;
- гістологічне дослідження (р.о. при глибоких мікозах);
- імунні та молекулярні методи.

Мікроскопічна діагностика

Мікроскопічна діагностика передбачає вивчення незабарвлених (нативних) та пофарбованих препаратів. Даний метод, як зазначалося, найбільше поширений у дерматологічній практиці через порівняльну нескладність і дешевизну, але, з іншого боку, буває недостатньо чутливим, вимагає в частині випадків повторних аналізів, підтвердження іншими методиками.

Так, при дослідженні незабарвлених препаратів крім елементів гриба, можна виявити епітеліоцити, клітини крові, різні забруднення з зовнішнього середовища, що ускладнює пошук збудника мікозу, потребує додаткової «підготовки» матеріалу – т.зв. «просвітлення» його (мацерації), концентрування, розведення тощо.

Все ж таки пряма мікроскопія нативних препаратів дозволяє досить швидко поставити діагноз мікозу, визначити, на які живильні середовища (при необхідності) слід засівати матеріал, існує думка, що позитивний результат її може залишатися єдиним лабораторним підтвердженням мікозу при негативній відповіді в культурі (А.Ю. Сергєєв, Ю.В.Сергєєв, 2003).

Серед різних варіантів «просвітлення» препаратів найбільш поширеним є додавання до досліджуваного матеріалу КОН або NаОН (частіше використовується для виявлення грибів у лусочках шкіри, волосся, а також ряду збудників глибоких мікозів в мокротинні, біоптатах).

Для мацерації подрібнених та поміщених на предметне скло лусочок проводиться 10-20% розчином їдкого натру (або калію) – 1-3 краплі, протягом 10-20 хв; препарат злегка притискають покривним склом, для швидшої мацерації - підігрівають на полум'ї до появи пари. Перегляд ведуть спочатку під малим збільшенням, потім під великим (суха система).

Правильно приготований препарат, що не зазнав грубих механічних, термічних і хімічних впливів, представляє картину гомогенної маси, що складається з епітеліоцитів, продуктів клітинного розпаду елементів гриба - ниток міцелію та спор.

Змінене волосся поміщають на предметне скло з 10-30% лугом і обробляють тим же способом, але більш тривало - від 20 хв до 3-4 год. При рясному вмісті пігменту рекомендують попередньо знебарвити волосся 5% розчином перекису водню. Надають значення виявлення елементів гриба, а також розташування їх по відношенню до волосся.

Підготовка матеріалу з патологічно змінених нігтів (краще тонкий порошок, отриманий зіскрібком з глибини вогнища) проводиться аналогічно, але з використанням 30% їдкого натру, обов'язковим обережним підігрівом на полум'ї до легкої пари та експозицією близько 1год (іноді до кількох годин). Оброблені лугом препарати не слід зберігати більше 1,5-2год зважаючи на їх «псування» (кристалізація реагенту, зниження діагностичної достовірності визначається мікроскопічною картиною).

Замість КОН або №ОН можна використовувати: а) розчин суміш КОН з 15% ДМСО; б) суміш фенолу (2 частини) з хлоралгідратом (2 частини) та молочною кислотою (1 частина); в) каліфлюоровий білий, що має спорідненість до хігі-ну та целюлози; для дослідження необхідний люмінесцентний мікроскоп (спостерігається блакитне або зелене світіння, що залежить від фільтру, що застосовується). При дослідженні ліквору (при підозрі на криптококоз) часто використовувалося забарвлення з тушшю.

Кулага В.В., Романенко І.М., Афонін С.Л., Кулага С.М.

Основою діагностики грибкових захворювань є мікроскопічне дослідження препаратів, виготовлених із уражених ділянок шкіри та нігтів. Однак мікроскопічна картина при різних видах мікозів подібна: у шкірних лусочках та нігтях видно спори грибків та гіллястий септований міцелій діаметром 4-7мкм. Тому рід і вид гриба в більшості випадків не може бути визначений за мікроскопічною картиною у шкірній лусочці або в зіскрібку з нігтя. Для ідентифікації збудника проводять посіви на живильні середовища найчастіше на середу Сабуро.

Епідермофітія.Уражається роговий шар шкіри, найчастіше стоп, і нігті нижніх кінцівок. Волосся ніколи не уражається. На нігтях з'являються жовті плями або смуги, потім розвивається гіперкератоз (потовщення нігтів), їхня деформація та руйнування. На шкірі стоп з'являється пластинчасте лущення підошв та міжпальцевих складок, почервоніння. Іноді утворюються бульбашки, попрілості, тріщини. Захворювання супроводжується свербінням, печінням, хворобливістю.

При мікроскопічному дослідженнізіскрібків, лусочок, покришок бульбашок визначаються малосептовані нитки міцелію діаметром 3-5мм, частина ниток розпадається на круглі та прямокутні суперечки.

Трихофітія.Це грибкове захворювання шкіри та її придатків з особливою схильністю вражати волосся [лат. trichosволосся + phytonгрибок]. На волосистій частині голови з'являються численні осередки ураження діаметром близько 1,5 див. Шкіра на них набрякла, гіперемована, покрита лусочками. Волосся в осередках обламується на рівні 2-3мм над поверхнею шкіри, звідки і назва «стригаючий лишай».

Мікроскопічне дослідження виявляє характерну особливість грибів виду трихофітону - розташування їх спір ланцюжками. Залежно від властивостей грибів розрізняють:

Endothrix (збудник поверхневої трихофітії). Гриби ростуть усередині волосся, різко змінюючи його структуру. Все волосся заповнене (нафаршироване) паралельними рядами ланцюжків, що складаються з великих округлих або квадратних суперечок;

Ectothrix (збудник глибокої трихофітії), при якому волосся оповите чохлом з дрібних або великих спор, розташованих уздовж осі ланцюжками.

Фавус – парша.Уражаються волосся та шкіра, рідше – нігті. Волосся стає тонким, тьмяним, «припудреним», як старовинні перуки, але не обламується. Для ураження шкіри характерна поява скоринок жовто-сірого кольору (щитків) з піднятими, як у блюдців, краями.

При мікроскопічному дослідженні виявляються бульбашки повітря всередині ураженого волосся.

Мікроспорія.Уражаються шкіра та волосся. У вогнищах ураження волосся обламується на рівні 6-8мм над поверхнею шкіри. Навколо пеньків, що залишилися, помітні білуваті чохли.

При мікроскопічному дослідженні ураженого волосся видно суперечки, що розташовуються навколо і всередині волосся мозаїчно (безладно). Вони дуже дрібні (1-3мм), звідси й назва хвороби. Діагностика мікроспорії допомагає характерне люмінесцентне світіння волосся.

При мікроскопічному дослідженні виявляють округлі клітини, що ниркуються, часто у вигляді виноградного грона.

Глибокі (цвілеві) мікози.Найчастіше зустрічаються як професійні захворювання на підприємствах з виробництва антибіотиків, у сільськогосподарських робітників, що контактують із запліснілим зерном, сіном, компостом і т.д. Збудник пеніциліозу (гриб-кистевик) має грубий, широкий, септований міцелій, що закінчується пензликом. Збудник мукорозу має широкий несептований міцелій, що закінчується сумкою зі спорами. Збудник аспергільозу (лійкова пліснява) часто міститься на запліснілих фруктах, хлібі. Має грубий септований міцелій, що закінчується розширенням, від якого відходять нитки зі спорами, що нагадують лійку зі струмками води.

Актиномікоз.Викликається різними видами променистого грибка. Характеризується утворенням на шкірі, слизових оболонках і внутрішніх органахщільних інфільтратів, схильних до нагноєння та появи свищів. На око в свищах, що відокремлюється, видно дрібні жовті зернятка з характерним променистим краєм - друзи актиноміцета. Препарати для мікроскопії готують з відокремлюваних нориць і мокротиння.

При малому збільшенні друзи променистого грибка мають вигляд жовтих утворень округлої форми зі світлою аморфною серединою і темнішим забарвленням по краях. При великому збільшенні у центрі друзи визначаються нитки міцелію, а, по периферії – колбовидные здуття. При фарбуванні за Грамом нитки міцелію Г+, а колбочки Г-.

Лабораторна діагностикагрибкових захворювань заснована на виявленні гриба та визначенні його роду та виду. Вона складається з двох основних етапів: мікроскопічного та культурального досліджень.

Мікроскопічне дослідження

Мікроскопічне дослідження є першою та важливою ланкою, що дозволяє підтвердити попередній діагноз.

Успіх мікроскопічного дослідження багато в чому залежить від правильного забору патологічного матеріалу. Для мікроскопічного дослідження необхідно вибирати волосся, що має помітні на око ознаки ураження грибом (тьмяне, обламане, потовщене). Змінене на зовнішній вигляд волосся витягує епіляційний пінцет. Для виявлення поодинокого ураженого волосся при мікроспорії можна скористатися люмінесцентною лампою з фільтром Вуда (зелено-блакитне свічення).

При відборі ураженого волосся можна використовувати низку додаткових ознак. Волосся, уражене мікроспорумами, в основі має сірий чохлик із зовнішньо розташованих спор. При хронічній трихофітії в товщі лусочок виявляються короткі сірого кольору вигнуті у вигляді «комок» і «знаки запитань» уражене волосся, а також «чорні крапки» (потовщене чорне, обломлене в гирлі фолікула уражене волосся). При інфільтративно-нагножувальній трихофітії для мікроскопічного дослідження, крім ураженого волосся, можна використовувати гній та скоринки з вогнища ураження.

З вогнищ ураження шкіри при мікроспорії, трихофітії та мікозі пахових складок лусочки необхідно зіскаблювати з периферичної зони вогнища ураження, де гриб знаходиться у більшій кількості. Пушкове волосся зіскоблюється разом із лусочками шкіри.

При дослідженні ураженого волосся при мікроспорії та трихофітії звертається увага на особливості розташування спор (всередині або зовні волосся) та їх величину. Ці дані дозволяють у ряді випадків уточнити діагноз, клінічну формумікозу та епідеміологію.

При міжпальцевій формі мікозу стоп для мікроскопічного дослідження використовують шкірні лусочки та уривки мацерованого рогового шару. Ділянка нігтя, яку необхідно взяти для мікроскопічного дослідження, залежить від форми оніхомікозу. При поверхневій формі необхідно робити зіскрібок з поверхні нігтьової пластинки.

При найчастішій дистально-латеральній формі використовується зіскрібок з нігтьового ложа, з-під пластинки (піднігтьовий гіперкератоз) з частиною зрізаної зміненої нігтьової пластинки. При проксимальної піднігтьової формі для забору матеріалу застосовуються спеціальні способи (висвердлювання вікон за допомогою бормашини, біопсія нігтя).

При сквамозно-гіперкератотичній формі мікозу стоп лусочки зіскаблюють з підошовної поверхні. При дисгідротичній формі мікозу стоп для дослідження зрізають покришки пухирів.

Техніка приготування матеріалу для мікроскопічного дослідження волосся . На предметне скло наноситься невелика крапля 30% КОН і в неї препарувальною голкою поміщається уражене волосся. Крапля з волоссям злегка підігрівається над полум'ям спиртування до появи парів над поверхнею рідини або випадання обідка кристалів по краю лугу. Після накриття покривним склом надлишок лугу видаляється фільтрувальним папером. Препарат досліджують спочатку під малим, потім під великим (х 400) збільшенням мікроскопа.

Шкірні та нігтьові лусочки . Тонкі нігтьові лусочки для мікроскопічного дослідження поміщають на предметне скло в краплю 30% КОН і нагрівають, додаючи луг при випаровуванні. Охолоджений незабарвлений препарат накривають покривним склом і мікроскопують.

Товсті шкірні та нігтьові лусочки поміщають у центрифужну пробірку та заливають декількома краплями 30% КОН. Пробірку нагрівають до кипіння та залишають на 20-30 хвилин. Частину розм'якшеного матеріалу скляною паличкою переносять на предметне скло, придавлюючи сірником до появи «хмарки», після чого мікроскопують.

Гній . Крапля гною змішується з краплею спирту навпіл з гліцерином та досліджується в нативному препараті.

Культуральна діагностика

Культуральна діагностика здійснюється для остаточного уточнення діагнозу та з'ясування епідеміології. Вона включає одержання культури гриба з подальшим мікроскопічним дослідженням.

Уражене волосся, лусочки (шкірні та нігтьові), покришки бульбашок або гній засівають на штучне живильне середовище. На вигляд гігантських колоній на чашках Петрі можна скласти уявлення про роді збудника (Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton), його вигляді (L. canis або ferrugineum, Т. violaceum, verrucosum або gypseum). Остаточне уточнення роду та виду гриба можливе лише на підставі мікроскопічного дослідження отриманої культури.

Лабораторна діагностика поверхневого кандидозу

Для лабораторного дослідження на дріжджоподібні гриби потрібний свіжий матеріал. Для мікроскопічного дослідження, залежно від клінічних проявів та локалізації уражень, можуть бути взяті лусочки шкіри, зіскрібки з нігтів, крапля гною з-під нігтьового валика, білуваті нальоти з уражених ділянок слизової оболонки рота та зовнішніх статевих органів, стінок піхви, зішкріб зі слизу. оболонки уретри, а також змив з червоної облямівки губ, уражених ділянок шкіри великих і дрібних складок.

Залежно від місця ураження і характеру клінічних проявів матеріал для дослідження беруть ватним тампоном, скальпелем, петлею тощо. Патологічний матеріал досліджують у незабарвлених або забарвлених препаратах.

У першому випадку матеріал змішують з рівною кількістю спирту з гліцерином. При забарвленні за Грамом дріжджові клітини і псевдоміцелій виглядають темно-фіолетовими, по Цилю-Нільсену - синіми, а по Романівському-Гімза - рожево-фіолетовими. При цьому відмітною ознакою дріжджової клітини є брунькування - виявлення фігури «пісочного годинника». Взяття матеріалу зі слизової оболонки ротової порожнини, статевих органів, зі шкіри червоної облямівки губ, з кутів рота, зі шкіри великих і дрібних складок здійснюється стерильним тампоном. Тампон після взяття матеріалу міститься в іншу стерильну пробірку з рідким суслом. Пробірка з тампоном прямує до мікробіологічної лабораторії. Виділення чистої культури дріжджоподібних грибів роду Candida проводиться за загальноприйнятою мікробіологічною методикою.

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА МІКОЗІВ

Взяти матеріал для лабораторного дослідження на грибок.

1. ОСТ 42-21-2-854: наказ № 222/80 від 27.06.00
2.Осначення: пінцет, предметне скло, ножиці, ложка фолькмана.
4. Показання: грибкові захворювання.
5.Ускладнення: ні.

Підготовка процедурного кабінету:

Зміна розчинів.

Приготувати:
-1% р-р хлораміну для ганчірки
-3% р-р хлораміну – для дезінфекції перев'язувального матеріалу та пінцетів
- миючий р-р(156 мл. перекису водню + 5 г. миючого порошку + 839 мл. дисцильованої води) - для обробки пінцетів
- 6% р-р перекисуводню – для обробки рукавичок.

Алгоритм виконання маніпуляції.

Потрібно взяти пінцет, предметне скло, ложку фолькмана, ножиці;
- Пацієнта запросити в перев'язувальну;
- Пацієнт сидить на стільці або кушетці;
- м/с стоїть.

Техніка виконання:

З вогнища ураження пінцетом взяти лусочки шкіри та волосся;
- взятий матеріал покласти на предметне скло та закрити іншим предметним склом.
- Вимити руки з милом;
- узятий матеріал відправити до лабораторії.

ЗБІР МАТЕРІАЛУ

Взяти ножиці та предметні стекла;
- ножицями відрізати шматочок від вільного краю нігтя;
- узятий матеріал покрити іншим предметним склом;

Ножиці та пінцет замочити у 3% розчині формаліну.

Правильний збір матеріалу з уражених нігтів – запорука успішного мікробіологічного дослідження. Забираючи матеріал, не завжди захоплюють ділянки нігтя, що містять життєздатні гриби. Нежиттєздатні гриби в культурі, природно, не виростуть, і їхній вид встановити не вдасться.

Ділянка нігтя, яку треба взяти, визначається формою оніхомікозу.

Так, при поверхневій формі оніхомікозу слід робити зіскрібки з поверхні нігтьової пластинки.

При найпоширенішій дистальній піднігтьовій формі найбільш життєздатні гриби розташовуються під нігтьової пластинкою. Матеріал, який направляють на дослідження, повинен включати не тільки обрізок нігтьової платівки, а й зішкріб з нігтьового ложа з-під платівки.

Крім того, слід захоплювати і області незміненого нігтя, оскільки на кордоні між ними та ураженими ділянками нігтя розташовуються найактивніші гриби.

При проксимальної піднігтьової формі брати матеріал важко. У цих випадках іноді, особливо якщо збираються проводити гістологічне дослідження або диференційну діагностику, роблять біопсію нігтя, рідко застосовують бормашину.

При пароніхія роблять соскоби з проксимального валика і з-під нього.

У всіх випадках, щоб уникнути бактеріальної контамінації, перед взяттям зразка слід обробити ніготь етиловим спиртом.

МІКРОСКОПІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

Мікроскопічне дослідження патологічного матеріалу на гриби проводять у нативних та пофарбованих препаратах.

Для приготування незабарвлених препаратів отриманий матеріал подрібнюють за допомогою скальпеля або препарувальної голки та поміщають на середину предметного скла. Для чіткішого виявлення елементів гриба роблять просвітлення (мацерацію) матеріалу. З цією метою вдаються до допомоги різних речовин, найчастіше їдкого лугу (КОН, NaOH), які розчиняють епідермальні лусочки, слиз, гній, просвітлюють пігмент волосся і тим самим роблять гриби доступними для дослідження.

На розм'якшені лусочки шкіри або нігтя, які поміщають на середину предметного скла, наносять 1-3 краплі 20-30% розчину КОН (NaOH). Досліджуваний матеріал у краплях лугу обережно підігрівають над полум'ям спиртування до появи ніжного білого обідка із кристалів лугу по периферії краплі. Підігрівати до кип'ятіння не слід. Після підігрівання краплю накривають покривним склом, уникаючи потрапляння бульбашок повітря.

Р. А. Аравійський та Г. І. Горшкова (1995) рекомендують просвітлені та накриті покривним склом препарати шкірних лусочок та волосся залишати на 5 – 10 хв, а нігтьових пластинок – на 30 – 40 хв до мікроскопування.

Просвітлення препаратів можна проводити без підігріву, для цього їх залишають у 20% розчині КОН на 30 - 60 хв або використовують інші методи просвітлення патологічного матеріалу: хлораллактофенолом за Аманом; лактофенолом; розчином, що містить по 15% диметилсульфоксиду та КОН у воді. Хороші результати одержують після просвітлення нігтьових пластинок, поміщених у 5% розчин КОН на 24 год, підігрівання в цьому випадку не потрібно.

Мікроскопічне дослідження проводять на звичайному мікроскопі лабораторному без імерсії.

Конденсор мікроскопа має бути опущений, діафрагма звужена. Спочатку препарат знаходять на склі при малому збільшенні (40х), подальше дослідження проводять при більшому збільшенні (100х);

детально препарат вивчають зі збільшенням 400х. Необхідно дослідити кілька препаратів для того, щоб збільшити надійність аналізу та уникнути хибнопозитивних результатів.

Помилки в мікроскопічній діагностиці грибів можуть виникнути у зв'язку з дефектами приготування препарату, так і з недостатньою дослідністю лаборанта.

Дефекти виготовлення насамперед бувають пов'язані:
з перегріванням препарату, що може призвести до випадання кристалів лугу, руйнування волосся та появи дрібнозернистого розпаду в патологічному матеріалі.

Лінійне розташування подовжених рівних кристалів лугу дуже нагадує нитки септованого міцелію навіть на чистому склі без патологічного матеріалу.

Диференціально-діагностичними ознаками є виняткова одноманітність кристалів, їх склоподібна прозорість, багатогранність країв та відсутність нерозривного зв'язку одного елемента з іншим. У сумнівних випадках рекомендується додати до препарату крапельки злегка підігрітої дистильованої води, що швидко розчиняють кристали лугу.

За елементи гриба помилково можуть бути прийняті:

- крапельки жиру,
- бульбашки повітря,
- бавовняні нитки одягу
- і так званий "мозаїчний грибок".

Ліпіди шкірних покривів, жировий розпад клітин та зерна кератогіаліну, що особливо мають правильну форму, можуть нагадувати окремі суперечки гриба. Але різноманітність форми і, головне, розмірів, відсутність внутрішньої структури утворень (вакуолі, оболонки) кажуть проти грибкової природи цих елементів. Ліпіди також можуть потрапити до препарату при взятті патологічного матеріалу з недостатньо очищеного вогнища ураження.

Пухирці повітря можуть нагадувати суперечки дріжджоподібних клітин, але на відміну від останніх вони оточені щільною темною оболонкою, і навіть найменші бульбашки повітря завжди більше клітин гриба.

Нитки від тканини шкарпеток, одягу тощо зазвичай лежать окремо від патологічного матеріалу, вони завжди більше гіфів, грубіше і не септовані.

«Мозаїчний грибок» є артефактом, який виникає в процесі кристалізації (можливо, за рахунок розпаду холестерину). Він має вигляд сіточки або петель, контури яких відповідають межам рогових лусочок, на відміну від ниток міцелію він ніколи не перетинає стінки клітин епідермісу.

У деяких лабораторіях просвітлення препаратів для мікроскопічного дослідження проводять 15 - 30% розчином КОН, який додають 5 - 10% комерційних темно-синіх чорнил фірми Паркер (Parker's Superchrome Blue-Black Ink).

При цьому забарвленні гіфи та суперечки забарвлюються у блакитний колір.

При мікроскопії виявляють ниткоподібні гіфи грибів або клітини, що брунькуються (рис.1).

Таким чином, мікроскопія дає висновок лише про грибкову природу інфекції, але не про вид гриба-збудника.

Звісно, ​​результативність мікроскопічного дослідження залежить від кваліфікації співробітника лабораторії.

Мал. 1. Мікроскопія зіскрібка з нігтів, уражених Т. rubrum. Видно гіфи гриба.

КУЛЬТУРАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

Проводять посів матеріалу на стандартне середовище Сабуро, часто із добавками антибіотиків. У діагностиці дерматофітних інфекцій прийнято додавати в середу Сабуро циклогексімід, який пригнічує зростання грибів-контамінантів, що потрапляють із повітря. Існують готові комерційні середовища з добавками антибіотиків та циклогексіміду. Слід пам'ятати, що багато цвілевих грибів-недерматофітів і деяких видів Candida не ростуть на середовищі з циклогексімідом, тому рекомендується робити посів на середу Сабуро з циклогексімідом і на середовище без нього. Ідентифікацію видів зазвичай проводять при мікроскопічному дослідженні культури, що виросла або шляхом пересіву на селективні середовища (рис. 2-15).

Мал. 2. Культура гриба Т. rubrum, виділеного із уражених нігтів. Отримана на середовищі Сабуро (ліворуч) та кукурудзяному агарі (праворуч).

Мал. 3. Культура гриба Т. mentagrophytes var. міжdigitale, виділеного з уражених нігтів. Отримана серед Сабуро.

Мал. 4. Культура гриба Candida albicans. Отримана серед Сабуро.

Мал. 5. Культура гриба Torulopsis glabrata, виділеного із уражених нігтів. Отримана серед Сабуро.

Мал. 6. Культура гриба Ulocladium sp., виділеного із уражених нігтів.

Мал. 7. Мікроморфологія Acremonium sp., Виділеного з уражених нігтів.

Мал. 8. Мікроморфологія Fusarium sp., вищеленого з уражених нігтів.

Мал. 9. Мікроморфологія Scopulariopsis sp., Виділеного з уражених нігтів.

Мал. 10. Мікроморфологія Candida albicans, виділеного із уражених нігтів.

Мал. 11. Мікроморфологія Altemaria sp., Виділеного з уражених нігтів.

Мал. 12. Мікроморфологія Aspergillus sp., Виділеного з уражених нігтів.

Мал. 13. Мікроморфологія Ulocladium sp, виділеного з уражених нігтів.

Мал. 14. Мікроморфологія Chaetomium sp., Виділеного з уражених нігтів.

Рис 15. Панель живильних фед для ідентифікації дерматофітів (ліворуч - культура Т rubrum, праворуч - Т mentagrophytes var. mterdigitale).

Зліва направо: середовище Сабуро, середовище Бакстера, середовище Христенсена, кукурудзяний агар

Слід врахувати, що деякі цвілеві гриби, у тому числі дерматофити, у культурі виростають повільно, за 2-3 тижні.

Навіть за дотримання всіх правил збору матеріалу, при хорошому обладнанні лабораторії та високій кваліфікації її персоналу кількість позитивних результатів культурального дослідження дуже невелика.

За даними зарубіжної літератури, відсоток позитивних досліджень вбирається у 50.
Відсоток позитивних результатів у найкращих вітчизняних лабораторіях ледве сягає 30.

Таким чином, у 2 з кожних 3 випадків оніхомікозу його етіологію встановити не вдається.

ЛЮМІНЕСЦЕНТНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

У 1925 р. Margaret і Deveze виявили, що волосся, уражене деякими дерматофітами, дає характерне свічення в ультрафіолетових променях, пропущених через фільтр Byда. Скло Byда складається з сульфату барію, містить близько 9% оксиду нікелю; воно пропускає промені завдовжки 365 нм. Як джерело ультрафіолетових променів можна використовувати різні прилади. Природа свічення точно не встановлена. Волосся продовжує світитися після загибелі гриба і після спроб екстрагувати матеріал, що флюорескує, гарячою водою або холодним розчином броміду натрію. Інтенсивність та характер світіння залежать від рН розчину. Вважають, що флюоресцентна субстанція з'являється в процесі взаємодії гриба і волосся, що росте.

Світіння в ультрафіолетових променях, пропущених через фільтр Вуда, характерне тільки для волосся, ураженого грибами роду Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, зрідка M. gypseum і M. nanum), а також Trichophyton schonleinii . Волосся, уражені мікроспорумами, особливо M. canis і M. audouinii, дають найбільш яскраве свічення; волосся, уражене Т. schonleinii, має тьмяну зелену флюоресценцію.

Світіння спостерігається тільки в повністю ураженому грибом волоссі. Його може не бути у свіжих осередках поразки. У цих випадках слід епілювати волосся з крайової, найактивнішої зони, і свічення можна виявити в кореневій частині волосся.

Люмінесцентний метод можна використовувати як для діагностики та контролю за ефективністю лікування в окремих хворих, так і в епідеміологічних осередках. Компактні пересувні установки зручні для обстеження контактних людей у ​​школах, дитячих садках тощо.

Люмінесцентне обстеження необхідно проводити в затемненій кімнаті, осередки ураження повинні бути попередньо очищені від кірок, залишків мазі і т.п. Вогнища ураження при цьому захворюванні мають червонувато-жовте або буре свічення. Це свічення, однак, не є строго специфічним, оскільки може спостерігатися за наявності лупи на волосистій частині голови і навіть у здорових людей в устях волосяних фолікулів на обличчі та верхній частині тулуба. Виявлене за допомогою люмінесцентного методу уражене волосся має обов'язково піддаватися мікроскопічному дослідженню.

ІМУНОЛОГІЧНЕ І БІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

Імунологічні методи дослідження використовують для виявлення специфічної перебудови організму та серологічної діагностики грибкових захворювань. Для виявлення специфічних антитіл у сироватці проби проводять такі серологічні реакції: аглютинації, преципітації, зв'язування комплементу, імунофлюоресценції з відповідними антигенами.

Алергічний стан організму хворого виявляють за допомогою шкірних алергічних проб. Алергени наносять на скарифіковану шкіру по Бірці або втиранням у шкіру по Моро, внутрішньошкірно по Манту, а також уколом у шкіру. З допомогою цих проб виявляють алергічні реакції як негайного, і уповільненого типу, що дозволяє оцінити стан гуморального і клітинного імунітету.

Для виявлення специфічної сенсибілізації лімфоцитів використовують реакції дегрануляції базофілів, агломерації та альтерації, тест бластної трансформації, придушення міграції макрофагів тощо.

Зіставлення результатів серологічних та алергічних реакційвиявляється корисним як для діагностики, так прогнозу перебігу мікозів.

Біологічний метод Використовується для лабораторної діагностики глибоких та особливо небезпечних мікозів. Заснований на зараженні тварин патологічним матеріалом від хворого чи культурою досліджуваного гриба. Здійснюється у спеціальних лабораторіях.

ГІСТОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

Гістологія мікозів шкіри, обумовлених дерматофітами

Патоморфологічні зміни в осередках ураження обумовлені впровадженням грибів у роговий шар епідермісу, волосся і нігті і запальною реакцією шкіри у відповідь, яка може бути гострою, підгострою або хронічною. Діагноз можна вважати встановленим лише в тому випадку, якщо у гістологічних препаратах виявляють елементи грибів. Для цього використовують різні гістологічні забарвлення, найінформативнішою є періодична кислотна реакція (PAS), що дозволяє виявити полісахариди, що є в целюлозі та хітині клітинної стінки більшості дерматофітів (забарвлення по Шифу та її модифікації). Можна також використовувати реакції сульфатування та імпрегнацію гістологічних зрізів сріблом [Хмельницький О. К., 1973; Lewer W. F. та Schaumburg-Lewerl., 1983].

Гриби в роговому шарі епідермісу, навіть при використанні спеціальних забарвлень, виявляються в невеликій кількостіу вигляді ниток міцелію та суперечка. У поодиноких випадках, коли грибів у вогнищах ураження багато, їх можна виявити у зрізах, пофарбованих гемотоксилін-еозином, у вигляді ніжних базофільних структур у роговому шарі.

Запальні зміни в епідермісі можуть бути різними: від незначного внутрішньо- та позаклітинного набряку шипуватих клітин до вираженого спонгіозу. Спонгіоз зазвичай розвивається при дисгідротичних варіантах мікозів стоп та кистей, клінічно у цих випадках відзначаються бульбашки. Причиною цієї реакції зазвичай є Т. mentagrophytes var. interdigitale. Іноді в епідермісі відзначається виражений гіперкератоз, що найчастіше спостерігається при мікозі, зумовленому Т. rubrum.

Гістологічні зміни в дермі неспецифічні та відповідають гострому, підгострому та хронічному запаленню.

При мікозі гладкої шкіри, викликаному Т. rubrum, гриби іноді виявляються в пушковому волоссі та волосяних фолікулах. Навколо фолікулів розвивається запальна реакція, яка за рахунок влучення в дерму грибів може набувати гранулематозного характеру. Центральна частина інфільтрату в цих випадках може піддаватися нагноєнню та некрозу, а периферична складатися з лімфоцитів, гістоцитів, епітеліоїдних та багатоядерних гігантських клітин, усередині яких іноді виявляються суперечки гриба. Розміри спор тут досягають 6 мкм у діаметрі, у волоссі зазвичай не перевищують 2 мкм.

При інфільтративно-нагножувальній формі мікозів волосистої частини голови та області росту бороди та вусів елементи грибів виявляються у волосяному фолікулі, всередині та навколо волосся. У волоссі вони визначаються трохи вище за зону початку кератинізації (приблизно на рівні 30 мкм). У дермі відзначають запальну реакцію різної інтенсивності, найбільш виражену при керіон Celsii. При гострій гнійній реакції у складі інфільтрату відзначають велика кількістьнейтрофільних лейкоцитів, елементи грибів у разі можуть повністю зникати. При хронічному перебігу процесу інфільтрат може набувати гранулематозного характеру, у ньому з'являються багатоядерні гігантські клітини. Для підтвердження діагнозу за відсутності в інфільтраті грибів можна використовувати імунофлюоресцентні методи фарбування. Для цих цілей застосовують мічену флюоресцином антисироватку до Т. mentagrophytes, яка дозволяє виявити антигени гриба у волоссі та у перифолікулярному інфільтраті.

Формування інфільтративно-нагнолюючої реакції шкіри при мікозі волосистої частини голови (kerion Celsii) та області росту бороди та вусів, обумовлених грибами М. саnis, Т. tonsurans і Т. verrucosum, є проявом імунологічної реакції. Про це свідчать:

1. Схильність вогнищ поразки до спонтанного дозволу.

2. Відсутність елементів гриба при дуже вираженій запальній реакції з боку шкіри при мікозі, викликаному Т. verrucosum (faviforme) та Т. tonsurans.

3. Постійна позитивна реакціяу відповідь на внутрішньошкірне введення трихофітину при інфільтративно-нагножувальних формах мікозу, викликаного зоофільними трихофітинами (наприклад, Т. tonsurans), і негативна - при поверхневих мікозах, обумовлених тим же Т. tonsurans.

При фавусі в роговому шарі епідермісу виявляється велика кількість ниток міцелію та поодинокі суперечки гриба. Скутула представлена ​​ексудатом, паракератотичними клітинами епідермісу, клітинами запального інфільтрату, а також нитками міцелію та спорами гриба, які розташовані переважно в периферичній зоні скутули. В активній стадії хвороби в дермі навколо дегенеративних волосяних фолікулів відзначається виражений запальний інфільтрат, що містить багатоядерні гігантські та плазматичні клітини. У старих осередках ураження волосся і сальні залозивідсутні, є явища фіброзу.

Гістологія мікозів шкіри та слизових оболонок, обумовлених дріжджоподібними грибами

При кандидозі шкіри та слизових оболонок гриби роду Candida виявляються у роговому шарі епідермісу або у поверхневих шарах епітелію слизової оболонки. Елементів гриба зазвичай мало, вони добре забарвлюються PAS-реакцією або за Грамом; представлені у вигляді ниток септованого гілкуючого міцелію, розміром 2-4 мкм у діаметрі, або овоїдними спорами, розміром 3 - 5мкм у діаметрі. Діагностичне значення має виявлення міцеліальної форми гриба.

При гістологічному дослідженні хронічного гранулематозного кандидозу шкіри та слизових оболонок елементи гриба також переважно виявляють у роговому шарі епідермісу або у самих верхніх відділахепітелію слизової оболонки, але іноді в шипуватому шарі, усередині волосся та в дермі. Відзначається також виражений гіперкератоз та папіломатоз; у дермі – густий запальний інфільтрат, що складається з лімфоїдних клітин, нейтрофілів, плазматичних та багатоядерних гігантських клітин. Інфільтрат може поширюватися у підшкірну жирову клітковину.

При висівковому лишаїу роговому шарі епідермісу виявляють велику кількість елементів гриба у вигляді ніжних базофільних структур, добре видно навіть при фарбуванні препаратів гемотоксилін-еозином. Гриби представлені як нитками, і спорами.

При фолікулярній формі висівкового лишаю відзначається скупчення рогових мас і клітин запального інфільтрату в розширених гирлах волосяних фолікулів. Навколо фолікулів також відзначають запальний інфільтрат. При PAS-реакції сферичні чи овальні суперечки гриба, розміром 2-4 мкм у діаметрі, виявляють усередині гирла волосяних фолікулів, інколи ж у перифолікулярному інфільтраті. Міцелій ніколи не виявляється.

Порушення пігментації шкіри у хворих на лишаєм обумовлено здатністю гриба Pityrosporum виробляти субстанцію, яка пригнічує процес пігментоутворення в епідермісі. Електронно-мікроскопічне вивчення біоптату шкіри з гіпопігментованих ділянок показало, що в меланоцитах утворюються дуже маленькі меланосоми, які не здатні проникати в кератиноцити. У гіперпігментованих ділянках шкіри, навпаки, великі меланосоми і містять велику кількість меланіну.

Основними в етіологічній лабораторній діагностиці мікозів дотепер продовжують залишатися класичні методи, Що включають мікроскопію матеріалу, виділення чистої культури збудника з подальшою ідентифікацією. Імунологічні методи діагностики мають допоміжне значення. Вони використовуються для виявлення найбільш значущих збудників: патогенних диморфних грибів, а також збудників криптококозу, кандидозу та аспергільозу. Методи геноіндикації (полімеразна ланцюгова реакція) також мають обмежене застосування через їх недостатню специфічність, але застосовуються переважно при діагностиці глибоких і опортуністичних мікозів.

Матеріалом для дослідження при лабораторній діагностиці мікозів залежно від форми захворювання можуть бути: шкіра та її придатки (волосся, нігті), що відокремлюється ран та свищів, мокротиння, кров, ліквор та сеча, тканинні біоптати. Правильністю взяття патологічного матеріалу великою мірою визначається ефективність подальшого лабораторного дослідження. При шкірних ураженнях матеріал відбирається найчастіше методом зіскрібків або з використанням липкої стрічки (переважно при поверхневих формах) до лікування зі свіжих вогнищ, що повністю розвинулися, по периферії, де знаходяться найбільш життєздатні збудники.

При виявленні грибів-дерматофітів надзвичайно інформативним матеріалом є волосся, оскільки характер ураження волосся дозволяє ідентифікувати збудника. Визначення вогнища ураження у ряді випадків допомагає використання лампи Вуда. Уражене волосся разом із лусочками витягується епіляційним пінцетом. При хронічній чорноточковій трихофітії волосся витягує зі шкіри препарувальною голкою.

Нігті відбирають протягом усіх шарів, зрізуючи гострим скальпелем чи ножицями. Найефективніший відбір із застосуванням зубного бура. При кандидозних ураженнях матеріал відбирається за допомогою зіскрібка з нігтьового валика. Відібраний матеріал доставляється в лабораторію в пакетах із темного паперу, щоб уникнути висихання та контамінації сторонньою мікрофлорою. Матеріал, що містить гній, доставляється у стерильних бакпечатках чи чашках Петрі. Мокрота відбирається у стерильний посуд. Дослідження мокротиння повинно бути проведене не пізніше 2 годин після збору. При подовженні термінів дослідження зразки повинні зберігатися в холодильнику при + 4 °С, інакше можуть виникнути помилки діагностики, пов'язані з появою псевдоміцеліальних форм дріжджових клітин.

Кров та спинномозкова рідина відбираються з дотриманням правил асептики. Посів крові здійснюється в рідке середовище Сабуро. Для запобігання контамінації зразків крові проводять їх повторні дослідження. Спинномозкову рідинуцентрифугують, а осад використовують для мікроскопування та посіву.

Сеча відбирається вранці в стерильну посудину, у своїй необхідно уникати забруднення матеріалу мікрофлорою шкіри промежини. Посів сечі здійснюється з використанням кількісних методів сівби.

У діагностиці мікозів використовуються препарати з нативного матеріалу, і пофарбовані. При дослідженні незабарвлених препаратів щільний матеріал попередньо просвітлюють 10-30% розчином КОН (можна використовувати розчини диметил сульфоксиду), а потім мікроскопують за методом «роздавленої краплі». Для надання контрастності препарати фарбують водним розчиномметиленового синього.

Забарвлення фіксованих мазків здійснюють у різний спосіб: по Граму, метиленовым синім, по Романівському - Гімзі. Останній спосіб дозволяє побачити дрібні дріжджові клітини та стадії фагоцитозу. Для криптококів використовують фарбування тушшю, фарбування з муцикарміном по Саутгейту. Меланинсодержащие гриби (темнозабарвлені), наприклад Cladophialophora bandana, фарбують за Масою - Фонтану (забарвлення меланіну, що входить до складу клітинної стінки). Флюоресцентні сироватки використовуються при діагностиці збудників глибоких мікозів, збудників дерматофітії, грибів роду Candida.

Виділення чистої культури збудника дає можливість встановити родову та видову приналежність гриба, вивчити його властивості та чутливість до антимікробних препаратів. Для виділення та ідентифікації грибів використовують щільні та рідкі живильні середовища Сабуро, сусло-агар. Ці середовища забезпечують зростання більшості патогенних та умовно-патогенних грибів. Крім того, середовище Сабуро (рис. 8.2) стимулює процеси пігментоутворення у грибів, що має значення при ідентифікації.

Для придушення росту бактерій-контамінантів у середовищі додають антибіотики: левоміцетин, стрептоміцин, пеніцилін, тетрациклін. Для виділення вибагливих патогенних грибів використовують середовища, збагачені кров'ю та серцево-мозковим екстрактом. Спеціальні середовища використовують для культивування та ідентифікації грибів: середа Чапека - для формування конідій при ідентифікації цвілевих грибів, картопляний (картопляно-морквяний) агар, рисовий агар - для виявлення типів росту та отримання хламідоспор при ідентифікації грибів роду Candida, морквяний (овочевий) агар - для отримання типових колоній культури гриба Trichophyton schonleini,середовище Кашкина - виділення пігментоутворюючих грибів. Використовуються і диференціально-діагностичні середовища, наприклад, для ідентифікації. albicans -хромогенні середовища чи середовища, що дозволяє визначити фосфоліпазну активність гриба.

Час інкубації грибів становить від кількох діб до 1 місяця та більше. При підозрі на патогенні диморфні гриби для видачі негативної відповіді, культивування проводиться протягом 8 тижнів.

Посіви проводять на середовища, розлиті пробірками, флаконами і чашками Петрі. Посіви матеріалу на гриби-дерматофіти здійснюють одночасно на кілька пробірок із середовищем. Матеріали, підозрілі на вміст цвілевих грибів (мокроту), засівають у 3 крапки та інкубують при 28 та 37 °С. Для вирішення питання про відсутність контамінації при заборі матеріалу здійснюють контрольні посіви повітря на вміст цвілевих грибів у приміщеннях лабораторії та палатах, де знаходяться хворі.

При культивуванні грибів у мікологічній лабораторії дотримуються заходів безпеки, аналогічні таким у бактеріологічних лабораторіях. Роботу з пліснявими грибами та мікотоксинами, щоб уникнути алергізації, персонал проводить у боксованих приміщеннях у марлевих пов'язках або в настільних боксах з витяжкою. Робота з культурами, що належать до II групи патогенності (патогенні диморфні гриби), можлива лише у спеціалізованих лабораторіях.

Ідентифікація видів грибів проводиться на основі комплексу культуральних, морфологічних та інших ознак. До перших відносяться морфологія колонії, її забарвлення та розміри при культивуванні на спеціальних середовищах, будова краю та центру, характер поверхні, наявність та характер репродуктивних органів, до других - особливості мікроскопічної будови міцелію, будова, форма та розміри репродуктивних органів - конідієносців, конідій, хламідоспор, артроспор і т.д.

Гриби формують різні типиколоній на щільних живильних середовищах Вчені з інституту Г. Вентера (США), враховуючи здатність грибів виділяти у середовище пігментні речовини, створили у живильному середовищі «новорічний ялинку» (рис. 8.3).

Мал. 8.3. «Новорічна ялинка» з грибів (верхівка: Talaromyces stipitatus; дерево Aspergillus nidulans;прикраси: Penicillium marneffei;пеньок: Aspergillus terreus)

Ферментативні та асиміляційні здібності культур мають велике значенняпри ідентифікації дріжджів (дріжджоподібних грибів). В даний час для ідентифікації грибів, що часто зустрічаються, - збудників захворювань людини і тварин - застосовуються комерційні тест-системи: BBL Mycotube, API 20С bio Merieux та ін.